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實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程， 通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區）

樣本前處理：

取動物組織及其制品、食品或飼料約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

2.DNA 提取

DNA 的提取采用DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.1試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

2.3步驟 循環數 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

3結果分析判定

3.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

3.2判斷

a)檢測通道 Ct 值≤30，有 FAM 熒光信號檢出，并出現典型的擴增曲線，判斷樣品為陽性。

b)當 30

4.質控標準

a)空白對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35，未出現典型的擴增曲線。

b)陰性對照：無FAM 熒光信號檢出或 Ct 值≥35，未出現典型的擴增曲線。

c)陽性對照：有 FAM 熒光信號檢出，并出現典型的擴增曲線，Ct 值＜30。

d)以上應同時滿足，否則本次實驗無效。