細胞表面分子流式檢測步驟說明注意事項

1． 在使用抗體之前，快速甩動一下，使之聚集到管的底部；

2． 熒光標記的抗體應該避光保存在4℃，不要冷凍；

3． 當染色的時候，固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號。為了得到更好的結果，染色后應該馬上分析。

過程概述：

1． 制作外周血、淋巴組織或者培養細胞的單細胞懸液；

2． 細胞染色抗體（包括直接標記抗體和間接標記抗體）；

3． 洗滌步驟棄掉所有的為束縛的試劑

4． 運行分析流式儀。

注意：流式細胞染色實驗中，所有實驗條件的優化都很重要。關鍵參數包括靶細胞、抗體效價以及動力學。

試驗A：小鼠淋巴細胞懸液的免疫熒光染色

材料：12×75 mm的圓底試管（Falcon Cat.No.2008）或96孔圓底微量滴定板（Falcon Cat.No.3910），原始抗體（既未純化也未偶聯），

緩沖液： eBioscience流式染色緩沖液（Cat.No.00-4222），流式鞘液

儀器：移液管和移液器，離心機，冰柜或冰箱，流式儀

試驗時間

半個小時細胞準備，半個小時抗體稀釋和樣品準備，半個小時到一個小時孵育過程，半個小時以上的運行和分析時間

方法細胞準備：

1． 采集組織（脾，淋巴結，胸腺），用注射器的活塞擠壓以制成單細胞懸液，此過程用10ml的染色緩沖液；

2． 轉移到50ml的圓錐形試管中并使大塊沉淀到試管底部或者通過尼龍濾網過濾，得到單細胞懸液；

3． 4℃ 離心沉淀細胞懸液4-5分鐘（300-400g），棄掉上清；

4． 如果上過程采集的脾，還用用RBC裂解，否則進入下一步；

5． 用50ml染色液重懸樣本，進行細胞計數和活力分析；

6． 再次離心細胞，棄掉上清，重懸細胞使其細胞數達到2×107 個/ml；