常見問題分析

1. 做標準曲線時候，可否用2個不同體系濃度的稀釋分別對于內參和目的基因？

建議最好用同樣稀釋倍數做曲線，因為模板濃度會影響擴增效率。

2. 熔解曲線中，Tm不出現在80度左右？

擴增片段100bp左右的，一般應該出現在80度左右。如果低于此溫度出現，可能是模板降解。

3. 擴增曲線沒有Ct值，僅僅一條斜線？什么原因？

模板濃度過低或者模板降解。

4. 如果內參和目標基因表達量差別比較大，也就是目的基因的表達量少，

Ctcon=15，Cttarget=38，可否應用？

可以用于數據分析。因為表達量低，從而用過高模板進行擴增，從而同內標的模板不同，反而會增大數據統計的誤差。

5. 引物濃度可否是50nM，是否太低？

如果擴增曲線和熔解曲線比較好，這個濃度當然可以。如果更低，擴增結果好的情況下，同樣可以運用。

一句話，所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的，會影響擴增效率。

6. miRNA多個擴增時候，如果一個的擴增效果比較，其它熔解曲線不止一個峰，如何解決？

Primer對于miRNA是專一的。所以重新設計引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應體系會影響反應產物的。

7. 相對定量方法，如果用Ct值比較，是各個樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好？

相對定量的方法各有優缺點，主要取決于實驗的目的和材料的準備。如果是材料群體個體差異不大，這2種方法基本沒有很大的區別；如果是個體差異比較大，建議用雙標準曲線做。就是分別做內參和目的基因的標準曲線，分別帶入Ct值計算。

8. 熔解程序可否不加？

如果是擴增效果好，特異擴增，可以不加熔解程序；但建議做好加上。

9. 擴增反應體系5uL，擴增效率低，什么原因？

反應體系小，各種因素的影響比較大，比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會影響擴增效率的。

10. 如何減少非特異性擴增的干擾？

設計一對好引物，提高primer的退火溫度，以及設定吸光溫度。

其他注意事項：   按照正確的開關機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進行實驗。關機順序：確認實驗已經結束后，首先關閉信號收集軟件，然后關掉定量PCR儀主機的電源，最后關閉電腦。 2.        應該定期備份您的實驗數據，備份頻率推薦每周一次，用光盤刻錄。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗數據， 3.        良好的實驗室環境有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面： 電源：推薦配備合適的UPS或穩壓器。 通風：儀器的通風應該沒有阻擋。 溫度：推薦實驗室配備空調，溫度應該控制在10-30°C之間。 濕度：20-80%；對于潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機。 空間：易于操作，安全。 4. 怎樣判斷定量PCR儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染     一個辦法是運行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執行ROI的校正，當某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。     清除樣本加熱塊污染的步驟如下：用移液器吸取少量乙醇并滴入每個污染的反應孔中。 吹打數次。 將廢液吸入廢液杯中。重復以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。確認反應孔中的殘留液體蒸發完。