實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質(zhì)測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。

1、Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的定義

在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念就是Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

2、熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

3、Ct值與起始模板的關(guān)系

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n為擴增反應的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

正常情況下，所有Ct值的范圍都應該在15-35之間，在22-26之間最理想。不過一些專家認為Ct值在10以上就可以接受，不需要那么嚴格。上限在35-40不那么準，但如果只是為了測個定性也可以接受。

4、Ct值的重現(xiàn)性

PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。